题目：WDR45 contributes to neurodegeneration through regulation of ER homeostasis and neuronal death
期刊：Autophagy 影响因子：11.05 主要技术： CRISPAR-Cas9、WB、IHC、TMT蛋白组学 、PRM蛋白靶向验证研究背景 宏自噬是降解受损细胞器和蛋白质聚集体的主要细胞分解代谢过程。在人类中，在自噬的多个步骤中起作用的各种基因的突变可引起广泛的神经退行性疾病。小鼠WDR45神经元特异性敲除可导致自噬和轴突变性功能障碍，运动协调性差和学习记忆障碍。因此，WDR45的主要功能是调节自噬体的形成，其功能的丧失会导致小鼠行为异常。但WDR45的丧失如何导致BPAN中的神经变性的机制仍不清楚。为了解决这些问题，本文作者构建了WDR45敲除小鼠来模拟BPAN病变的复杂过程，并且利用TMT定量蛋白质组学技术和一系列细胞水平的验证实验来阐明BPAN样病理变化的分子机制。
技术路线
图2 WDR45敲除小鼠在老年时在前额叶皮质和黑质中表现出神经元丢失
3.脑组织定量蛋白质组学分析揭示了内质网（ER）蛋白在基因敲除小鼠脑中的积累
作者设计了3个10标TMT定量蛋白组学实验，分别研究了5对野生型（WT）小鼠和敲除（KO)小鼠的大脑前额叶皮层（PFC）、海马（HIP）和中脑（MIB）组织的差异定量蛋白组学。共定量到近4000个蛋白，以FC>1.5，P
图4 生物信息学分析显示内质网（ER）蛋白在WDR45 KO小鼠体内积累
4.WDR45通过蛋白酶体和溶酶体途径调节靶ER蛋白 接下来，作者研究WDR45如何调节内质网蛋白的水平。首先，Western blot 实验结果证实WDR45 KO小鼠中脑内源性SEC22B显著上调，与质谱定量结果趋势一致。然后，作者在存在或缺乏BAFA1（一种阻止自噬体溶酶体融合的自噬抑制剂）或MG132（一种蛋白酶体抑制剂）的情况下共表达WDR45和4个内质网蛋白，结果表明，BAFA1可有效地阻断WDR45介导的SEC22B降解，而BAFA1和 MG132均可阻断WDR45介导的BCAP31降解。而对照组，只有MG132对GFP的稳定性有轻微影响。这些不同的作用结果表明，位于内质网不同部位的蛋白质被不同的机制降解。此外，在细胞中通过shRNA敲低WDR45，与敲低Scrbl 相比，所有四种ER蛋白质在sh-WDR45的细胞都有积累，与KO小鼠脑中观察到的效果类似。这些结果表明WDR45对内质网蛋白亚群的稳定性有负面影响。
图6 WDR 45缺失细胞表现为ER应激增加，ER面积增加
6.WDR 45缺失导致ER应激后细胞死亡增加
接下来的实验结果表明，在WDR45缺失的原代神经元中，ER标记的Calr水平升高，自噬受体SQSTM1积累，LC3-II:LC3-I比率降低。作者利用western blot和免疫组化的方法对小鼠脑中以SQSTM1积累为特征的自噬缺陷和LC3-II：LC3-I水平降低，以HSPA5，DDIT3 / CHOP为特征的ER应激增加以及ERN1 / IRE1途径的激活，以及最终增加的细胞凋亡进行了重新描述。内质网应激诱导的细胞凋亡以CASP12的断裂为特征，在16个月龄时，作者还发现WDR45 KO小鼠PFC区CASP12的断裂增加。但在脑组织中UPR通路的激活存在差异。KO小鼠EIF2A磷酸化增加，提示EIF2AK3活化，ERN1/IRE1磷酸化和ATF6（N末端）水平变化不显著。在1月龄的KO小鼠中没有观察到内质网应激、未折叠蛋白反应和凋亡的缺陷，这与衰老是神经退行性变的一个重要危险因素的观点一致。
图8 激活自噬或抑制UPR可挽救异常蛋白质加工并增加WDR45缺失细胞的细胞死亡
小结 该研究利用CRISPAR-Cas9构建了WDR45 基因敲除小鼠，然后利用RT-PCR、PRM分别从基因水平和蛋白水平验证WDR45的敲除效果。一系列动物行为学实验，包括morris水迷宫实验、8臂迷宫试验、条件性恐惧实验、旋转实验等结果显示WDR45基因敲除小鼠具有认知障碍。然后作者利用3 x 10标TMT实验从分子层面研究了小鼠大脑组织的定量蛋白质组学，发现在基因敲除小鼠中的积累了大量的内质网（ER）蛋白。而后作者从细胞水平上验证发现WDR45缺乏可引起内质网蛋白积累，从而导致内质网应激增加和内质网质量控制受损。未折叠蛋白反应通过ERN1/IRE1或EIF2AK3/PERK途径升高，最终导致神经元凋亡。通过MTOR抑制内质网应激或激活自噬可减少细胞死亡。因此，WDR45的缺失会削弱神经元的宏自噬机制，并导致细胞器自噬的损伤，提供了对BPAN病因的机制性理解和治疗这种遗传性疾病的潜在治疗策略。
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