衰老是一个复杂的生理过程伴有代谢和免疫功能退化，是老年性疾病发生的原因之一。从出生开始，微生物系统就在胃肠道等部位建立，随后在机体生长、发育、成熟和衰老过程中发挥重要作用。与肠道菌群相关的代谢物则是影响癌症、心血管疾病等多种疾病发生发展的重要信号分子。衰老的特征是低水平的全身性慢性炎症，称为炎症衰老（inflammaging），是与年龄相关疾病的发病机制之一。肠道菌群可能通过代谢作用影响机体衰老过程中的炎症反应，但两者之间的关系尚不清楚。上海交通大学系统生物医学研究院团队与上海交大附属第六人民医院转化医学中心合作，采用16s-rRNA测序、代谢组学技术、免疫因子研究雄性Wistar大鼠的微生物组、代谢组和免疫因子在寿命中的相关性，作者将差异分析、相关分析和网络分析方法用于代谢组和微生物组数据分析，揭示大鼠血清代谢组、肠道微生物组和免疫指标随年龄的变化规律，并建立三者之间的联系，相关成果发表于《Geroscience》，第一作者为张霞、杨玉萍和苏娟，通讯作者为陈天璐、王晓艳和贾伟教授。
大鼠血清代谢物分析
血清代谢组检测到82个代谢物，分别为氨基酸24个、碳水化合物15个、脂肪酸11个、有机酸19个、其他小分子13个，代谢组结果提示年龄是影响健康大鼠代谢的主要因素。7个时间点代谢物经Kruskal-Wallis检验筛选出显著差异的代谢物，亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和异亮氨酸等随年龄增加而增加，而4-羟脯氨酸、赖氨酸和脯氨酸则随年龄而减少(图2c)。有趣的是，几种碳水化合物水平在第9周出现了分离，如甘油、赤藓糖醇和半乳糖从W1到W9呈降低趋势，而从W9到W111呈升高趋势。葡萄糖酸盐和葡萄糖醛酸盐从W1增加到W9，从W9减少到W111(图2d)。与其他年龄组相比，W1组的十四酸盐、十二酸盐、十酸盐和二十二碳六烯酸盐水平极高。二十二碳六烯酸盐、油酸盐和亚油酸盐从W1下降到W9，又从W9上升到W111(图2e)。
大鼠肠道菌群分析
利用16S rRNA测序，在427个ASVs中共注释到73个属26个菌种。使用PCoA分析呈现7组大鼠肠道微生物组组成的总体差异，并分析了各组优势菌属和菌种的相对丰度（Kruskal-Wallis检验，p值Rhodococcus spp.）、放线杆菌属（Actinobacillus spp.）和芽孢杆菌属（Bacillus spp.）含量显著增加。Bifidobacterium spp.、Lactobacillus acidipiscis.、Akkermansia muciniphila.、 Rothia spp.的相对丰度在 (W1~W7) 发育阶段显著升高，而从W9开始下降，在W56和W111时达到极低水平(Fig. 3c)，而Turicibacter spp.和Lactobacillus reuteri.仅在成年期较高(W7~W12)。
代谢物-菌群-免疫因子相关性分析
本研究具体流程如下图（图1）所示：
图1. 研究流程示意图
收集大鼠（Wistar，n = 42）正常生命周期7个时间点的血清、回肠内容物和脾脏样本，分别采用GC-TOF/MS质谱平台、Illumina MiSeq测序平台和ELISA试剂盒等对样本进行检测，得到5个数据集：
1. 血清中的82个代谢物（来自于9个类）丰度表；
2. 肠道内容物427个ASVs（来自于16个门）丰度表；
3. 肠道内容物99个菌属/种丰度表；
4. 由肠道菌群数据预测的127个与代谢相关的功能丰度表；
5. 7个免疫指标浓度表。
考虑到不同组学的数据层次结构和数据特征的差异，该研究采用了高低两个层次的相关分析来确定血清代谢组和肠道微生物组之间的相互关系。
高层次相关分析
采用基于先验知识（图2）和基于数据（图3）两种方法，对血清代谢组和肠道微生物组数据进行降维，再进行Spearman相关分析。通过高层次相关分析，确定了四个重要的关联对。前三个为基于先验知识方法获取的代谢物-肠道菌代谢功能关联对，主要涉及氨基酸类、尿酸类代谢物和肠道菌的氨基酸代谢功能、脂质代谢功能及异源物质的降解和代谢功能；另一个为基于数据方法获取的代谢簇M01—肠道菌簇B05关联对，两者与年龄的相关性最强。M01包含脯氨酸、4-羟基脯氨酸、赖氨酸，三者均与年龄呈现负相关关系。B05包括多种益生菌，如Rothia spp.、Bifidobacterium spp.、 Lactobacillus acidipiscis和Enterococcus spp.，这些益生菌也均与年龄呈现负相关。现有研究表明，这些降低的代谢物和肠道菌在个体衰老中发挥重要作用。
图2. 基于先验知识的代谢物种类和肠道菌群功能的相关分析
图3. 基于数据降维的大鼠代谢簇和肠道菌簇相关性分析
低层次相关分析
对所有代谢物、菌属/种和免疫指标数据矩阵进行两两相关分析（Spearman相关分析），建立“代谢物-菌属/种-免疫因子”关联对，构建年龄相关分子网络（图4）。通过低层次相关分析，作者发现了更多相互作用的关联对，包括年龄相关的代谢物Tetradecanoate、dodecanoate、Decanoate与B04中Glycomyces spp.、 Olivibacter spp.、 Phascolarctobacterium spp.、 Pedobacter spp.、 Phenylobacterium spp.等呈正相关，与B06中Sphingobium spp.、 Anaeroplasma spp.、 Chitinophaga spp.、 Cellvibrio spp.呈正相关。
图4. 根据低层次分析结果构建的显著相关的代谢物-肠道菌-免疫因子网络图
两个相关变量对(菌群-代谢物、免疫因子-菌群、免疫因子-代谢物)的百分比显示免疫因子与代谢物的相关性随年龄增长而下降(图4a)。图4b网络图显示IL-10、IgM、IgA、4-羟脯氨酸和十四烷酸是重要关键节点，可见氨基酸、长链脂肪酸与免疫因子和细胞因子有更强的相关性。IgA与肌苷成正比，4-羟脯氨酸和脯氨酸成反比。IL-10、IgM、IgA、IgG、NK与肠道菌群显著相关，其中IL-10与Lactobacillus spp., Lactobacillus reuteri, Bacillus spp., Flavobacterium succinicans呈正相关，与Cellvibrio spp., Clostridium spp., Clostridium celatum呈负相关。脾脏IgA与Flavobacterium succinicans, Actinobacillus spp., Cupriavidus spp., Rhizobium spp., Rhodococcus spp. , Salinispora spp. 呈正相关，与Rothia spp., Bifidobacterium spp., En- terococcus spp., Candidatus Arthromitus呈负相关，提示免疫因子与回肠菌群高度相关。
图5.多组学数据的低层次相关分析
小结
本研究发现回肠微生物组和血清代谢组在衰老过程中发生了显著变化。通过基于先验知识和基于数据的高层次分析，联合低层次相关分析，发现了血清代谢物-肠道菌-免疫因子重要关联对，其中与年龄相关的关键代谢物如4-羟脯氨酸、脯氨酸和赖氨酸聚类在一起，并与肠道菌群如Bifidobacterium、Lactobacillus、Akkermansia呈正相关；功能分析探讨了血清代谢物种类与特定肠道细菌代谢途径的关系；相关性分析展示了IL-10、IgA、IgM、IgG等主要免疫因子与关键肠道菌群及血清代谢物之间相互作用网络，为了解衰老过程中血清代谢组、肠道微生物组和免疫因子之间的互作关系提供了新的见解。
后记
本研究贾伟教授生信研究团队所开发和使用的关联分析方法在2018年《Analytical chemistry》发表的关联方法上进一步优化和提升同时考虑协变量，使得菌群-代谢组关联方法更为先进，数据结果更加完整！
参考文献
2. Strategy for an Association Study of the Intestinal Microbiome and Brain Metabolome Across the Lifespan of Rats[J]. Analytical chemistry, 2018,90(4):2475-2483.
3. A computational framework to integrate high-throughput '-omics' datasets for the identification of potential mechanistic links. Nat Protoc. 2018;13(12):2781–2800.
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