编者的话 微生物群聚附着于物体表面形成膜状构造，此构造泛称为生物膜，已知生物膜的形成可影响其于叶表适存性，有助于微生物抵抗抗生素等不良环境，且此过程在多种微生物亦已被证实为致病、拮抗或共生作用的关键，因此干扰或抑制生物膜形成为研发病害防治策略标的。
福建省是柑桔主产区，柑桔溃疡病普遍发生，主要采用铜制剂农药防治。台湾黄姿碧系统研究了柑桔溃疡病菌数据于柑桔叶表形成生物膜作用及其在溃疡病害致病过程所扮演角色与调控的分子机制，探讨如何应用影响病原菌生物膜及缠据能力或干扰调控致病过程的细胞间讯息传递系统作为病害防治策略。很有参考价值。
柑桔溃疡病菌生物膜形成与致病性调控机制及病害管理应用
黄姿碧
台湾中兴大学植物病理学系
绪言
亚洲型柑桔溃疡病主由柑桔溃疡病菌（Xanthomonas axonopodis pv.citri）所造成，是台湾及国际影响柑桔产业最具威胁的细菌性病害，不仅严重影响柑桔质量与产量，造成严重的经济损失，亦是世界各国检防疫单位所重视的病害。在美国此病害即列为管制，并花费不赀极力铲除。台湾目前虽建议使用波尔多液、氧化亚铜、嘉赐铜、氢氧化铜及维利霉素等防治此病害，但报导指出此病原或同属种病原已有抗铜剂菌系出现，且其抗性基因已被解析，无法有效抑止此病害的蔓延及传播，因而砍除及销毁植株为国际间目前不得已而采行的最有效防治策略。在美国柑桔主要产区佛罗里达州陆续有3次大规模溃疡病发生，第一及二次分别发生在1913及1986年，在耗时20年、斥资600万美元后，才宣告完全扑灭。近年来又死灰复燃，加上2004及2005年两大飓风肆虐，此病害蔓延日趋扩大，虽依State/Federal Citrus Canker Eradication Program (CCEP)管制法规“1900-ft law”下，砍除罹病株方圆1900英尺的植株，在耗时10年并花费100万美元后，预估得再移除剩下柑桔产区的25.7%柑桔园，因数量过多，而在2006年宣告终止砍除作业，但佛罗里达州柑桔苗木仍被列为监测及管制对象。而台湾近年来亦因此病害而限制本土产柑桔的外销，各农政相关单位无不积极寻求解决方案，因此发展更有效的策略来防治柑桔溃疡病为势在必行。在致病过程、共生作用、拮抗反应等微生物交互作用中，微生物间的讯息沟通系统扮演重要角色，此讯息沟通系统为微生物感知环境中族群量改变，自行调控其生物功能的机制，因此干扰此讯息传递系统被视为研发抗菌物质、抑制病原感染、疾病治疗药剂或调控微生物功能之利器。
本文章中主要汇整近年来有关柑桔溃疡病菌数据于柑桔叶表形成生物膜作用及其在溃疡病害致病过程所扮演角色与调控的分子机制等研究结果，另探讨如何应用影响病原菌生物膜及缠据能力或干扰调控致病过程的细胞间讯息传递系统作为病害防治策略。
柑桔溃疡病菌的生物膜形成机制与调控
微生物群聚附着于物体表面形成膜状构造，此构造泛称为生物膜（biofilms），已知生物膜的形成可影响其于叶表适存性，有助于微生物抵抗抗生素等不良环境，且此过程在多种微生物亦已被证实为致病、拮抗或共生作用的关键，因此干扰或抑制生物膜形成为研发病害防治策略标的。国际间目前仅有少数有关柑桔溃疡病菌生物膜形成与于寄主缠据性相关研究，而生物膜的形成为柑桔溃疡病菌决定其于叶表适存性及形成溃疡病斑所不可或缺。目前已被发现参与柑桔溃疡病菌生物膜形成及调控的因子包括: 二元反应讯息传递系统（two-coponent signal transductionsystem） ColS/ColR、类丝状血球凝集素（filamentous hemagglutinin-like protein，由fhaB生合成）、鞭毛蛋白（flagellin，由fliC 生合成）、UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase（其基因为galU）、三仙胶（xanthan）生合成基因群组中gumB及gumD、与脂多糖（lipopolysaccharide）生合成相关基因wxacO 及rbfC。另利用跳跃子突变配合生物膜缺失菌株进行柑桔溃疡病菌菌株306全基因体基因筛选，Wang 研究团队发现异于上述亦参与溃疡病原生物膜形成作用的相关基因及路径，而其中有7个基因为参与讯息传递及调控路径、5个基因其于生物膜形成过程所扮演的角色仍未知，另亦发现XAC0482（为一haloacid dehalogenase-like phosphatase）、XAC0494（其命名为rbfS为二元反应感应蛋白）及由鞭毛驱动或非鞭毛依赖性的泳动性亦为此病原形成成熟生物膜所必需。近期Kraiselburd等人则发现柑桔溃疡病菌缺乏蓝光接受蛋白Lov（light，oxygen，voltage）则会改变此菌体生物膜形成能力、泳动性、胞外多糖体产生能力，另亦影响其附着于生物与非生物表面的能力及病征发展。本研究室关于台湾所收集的柑桔溃疡病菌在不同品种柑桔叶上造成差异性病征的分子机制的研究，比较了在葡萄柚叶上形成差异性病征之溃疡病菌XW19与XW47菌株，其形成生物膜能力的差异结果显示引起病斑呈扁平坏疽水浸状边缘的菌株XW47于聚苯乙烯多孔盘中与柑桔叶上所形成生物膜的能力，较造成典型裂开突起且边缘具水浸状病征菌株XW19低。为了解生物膜形成能力与病征表现是否具相关性及影响生物膜形成的分子机制，研究中利用跳跃子进行菌株XW19基因体的随机突变，筛选生物膜形成能力明显较野生型菌株XW19为低的菌株，已证实至少有6个基因参与生物膜形成（未发表成果）。其中一突变菌，跳跃子插入使其丧失功能的基因序列， 推测其为二元反应调控蛋白（two-componentresponse regulator， 命名为BfdR [biofilm formation defective，regulator])，其在非生物性表面以及生物性表面上，形成生物膜能力皆明显低于野生型菌株，且接种于葡萄柚叶片上，可发现罹病度较野生型菌株为低。综合上述试验结果，证实柑桔溃疡病菌XW19于叶表形成生物膜及缠据能力为溃疡病征表现关键因子，而此生物膜形成过程可由二元反应调控蛋白BfdR调控。
柑桔溃疡病菌的致病因子与讯息传递机制
柑桔溃疡病原主要由气孔或伤口侵入感染叶、茎干、枝条或果实，此感染常可见其于叶表形成圆形班，其后细菌缠据于原生质体外导致细胞不正常增生，而造成叶表皮破裂，而在受感染叶、茎干、枝条或果实也常可见突起坏疽木栓化病斑，此病原持续在病斑中增殖，待高湿环境下则可传播至另一健康植株。于公元2002年，柑桔溃疡病菌菌株306基因体序列被解析完成，学者们试图由比对与其亲缘关系相近的甘蓝黑腐病原Xanthomonas campestris推敲柑桔溃疡病原致病过程相关机制，亦有利用DNA macroarray或跳跃子随机突变法配合生体内病原性测试筛选了解参与溃疡病征发展因子。Gottig等人归纳截至目前相关研究指出柑桔溃疡病原柑桔溃疡病菌可利用多种机制缠据感染寄主，其附着于寄主表面主要依赖特定镶嵌于外膜上的粘附素（adhesins），如类丝状血球凝集素FhaB，一旦附着于寄主表面，其可藉由第三型分泌系统（type Ⅲ secretion system）送出致病有效蛋白（pathogenicityeffectors）改变寄主防御反应系统使之有利其侵入感染。为能长久于寄主植物内存活，此病原在对数生长末期及停滞生长期会大量生成胞外多糖，如xanthan，此外FhaB 和鞭毛亦会参与以形成生物膜结构，加强此病原于寄主缠据能力。随后柑桔溃疡病菌则利用可能经由水平基因转移（horizontal gene transfer）所获近似于植物的plant natriuretic peptides，影响植物生理生化功能，如打开植物气孔、增加植物光合作用而使植物于病原侵入感染过程中维持健康组织状态，及增加病原存活性并降低寄主植物防御能力。另由扩散性讯息因子（diffusible signal factor, DSF）媒介的regulation ofpathogenicity facor（rpf）数量感知系统亦被报导可正调控胞外多糖[如extracellular cyclic β-（1，2）-glucan]、胞外酵素（如proteases）和endoglucanases 的产生及鞭毛及非鞭毛所驱动的泳动性，而影响其感染寄主植物的能力。截至目前虽有多个基因被报导参与柑桔溃疡病征发展过程，然其间调控机制、路径、功能与相关性仍有待进一步探讨。数量感知作用已知为微生物随环境中族群量改变，自行调控其生物功能的机制。已知与柑桔溃疡病菌 亲缘关系相近的X. campestris，不同于大部份革兰氏阴性菌，不利用acyl-homoserine lactone（AHL）为数量感知讯息分子，而是藉由脂肪酸衍生物的扩散性讯息因子DSF来调控其生理生化机能，如X. campestris 分泌产生cis-△2-11-methyl-dodecanoic acid，可调控胞外酵素与多糖体生合成等致病因子而造成十字花科黑腐病征表现。而X. campestris的DSF 生合成与调控基因则位于rpf 基因群组（rpf gene cluster），此基因群组共有9个基因rpfABFCHGDIE，其中rpfF、rpfB 为生合成DSF 所必需，并由二元反应调控系统rpfGHC 所调控。由基因体序列比对分析可知与Xanthomonas亲缘关系相近的植物及动物病原含柑桔溃疡病菌、X. oryzae、Xyllela fastidiosa、Stenotrophomonas maltophilia及Burkholderia cenocepacia皆具rpf基因群组，然其结构组成略有不同；而扩散性讯息分子结构亦各有差异，大部分DSF 类讯息分子在第2 个碳链上具顺式不饱和双键（cis-unsaturated double bond），其碳链长短各有不同，部分菌株产生者具甲基化分支。由X.campestris产生的DSF- cis-△2-11-methyl-dodecanoic acid，与真菌Candida albicans 所产生调控酵母-菌丝型态转变的讯息分子farnesoic acid 结构相近)，且已被证实cis-△2-11-methyl-dodecanoic acid 亦具有抑制C. albicans双型性转变（dimorphic transition）的功能，因而亦被认定为一横跨生物界的讯息传递分子（cross-kingdom communication signal)。
本研究室研究成果显示台湾所分离的X. axonopodispv. citri XW19菌株亦具rpfF、rpfB 与rpfGC等基因，而不具rpfH，与柑桔溃疡病菌306菌株基因组成相似。但截至目前由柑桔溃疡病菌所分泌的扩散性讯息分子之结构是否同于cis-△2-11-methyl-dodecanoic acid 尚未被解析，而此系统是否亦参与柑桔溃疡病原调控生物膜形成过程则有待进一步研究证实。
二次讯息传递物质（second messenger）cyclic di-GMP 与Xanthomonas 菌属讯息传递系统的调控
3,5-cyclic diguanosine monophosphate（cylic di-GMP）由两个guanosine triphosphate（GTP）分子结合经guanylate cyclase 转化生成，为一水溶性物质，于细菌中扮演二次讯息传递物质角色。此物质于1987年首次在Gluconacetobacter xylinus被发现，可活化此菌的纤维素生合成酶 （cellulose synthase）。目前已知此物质普遍存在于细菌细胞内，负责调控菌体的各种代谢反应，如：抑制菌体泳动性（motility）、促进粘附素、胞外多糖等生物膜生成所需基质、调控毒力基因（virulence gene）表现及抗生物质产生等。而菌体内的cyclic di-GMP的浓度受到不同的酵素蛋白作用影响，其中diguanylate cyclase（DGC）具GGDEF domain，已知具有生合成cyclic di-GMP的作用，而phosphodiesterase （PDE）具EAL domain或HD-GYP domain，则参与cyclic di-GMP的水解作用。而Xanthomonas菌属讯息传递系统所调控的毒力基因表现及于环境的适应性同样也受到cyclic di-GMP 影响，以X. campestris 及柑桔溃疡病菌中调控扩散性讯息分子DSF 生合成的RpfC/RpfG 二元反应调控系统为例：RpfC 为一hybrid two-component regulatory protein，具有5个transmembrane domains、1个histidine kinase domain、1 个receiver domain（REC）及1 个histidine phosphotransfer domain； RpfG为一response regulator，在N 端具有REC domain，而在C 端则具有HD-GYP domain，可与带有GGDEF domain的蛋白作用以调控c-di-GMP 在细胞内之含量，进而调节其生物膜形成与毒力表现。当菌体族群密度高时，胞外累积的足够的DSF浓度，RpfC藉由磷酸根的传递，活化RpfG的HD-GYP domain的PDE酵素活性，导致cyclic di-GMP 的浓度下降，而无足够的cyclic di-GMP 与global transcriptional factor Clp作用，Clp便可进而启动下游的毒力、生物膜形成及泳动性相关基因表现。Deng等人近期研究于B. cenocepacia DSF生合成基因rpfFBC 附近序列鉴别出一调控蛋白，命名为RpfR，其具PAS、GGDEF及EAL domains，可藉由调控cyclic di-GMP 而影响此菌体泳动性 （swarming motility）、生物膜形成能力与毒力因子protease 产生。综合上述结果显示，细胞内二次讯息传递物质cyclic di-GMP 浓度为细菌调控生物膜形成与毒力表现的重要因子，而此cyclic di-GMP的生成及降解主要可藉由rpf/DSF 讯息传递系统中分别具有GGDEF domain及EAL或HD-GYP domain的蛋白调控。
应用影响病原生物膜形成及缠据能力作为病害防治策略
根 据 文 献 指 出 已 知 多 种和 植 物 相 关的细 菌（plant-associated bacteria），如Agrobacterium tumefaciens、Bacillus subtilis、Pseudomonas putida、P. fluorescens、Pantoea stewartii、Sinorhizobium melilotii等，皆可在植物叶表、根圈或植物细胞与维管束内形成生物膜，此生物膜的形成亦被证实在其是否能造成植物病害或保护植物、促进植物生长与抗病性等植物与微生物交互作用中扮演重要角色。Hentzer等人研究发现，由红藻萃取的furanone物质可影响P. aeruginosa 生物膜结构，促使菌体提早脱离生物膜，并降低毒力因子表现，如elastase 及抑制AHL 媒介之数量感知作用；且应用老鼠pulmonaryinfection model，发现P. aeruginosa 以生物膜形式存在老鼠肺中，若以此furanone 物质处理受P. aeruginosa 生物膜感染之老鼠，可促使P. aeruginosae 及时从老鼠肺部被免疫系统清除。
而Bacillus 菌属能否缠据植物表面，普遍被认为是影响其应用于生物防治是否成功的关键，因此了解其于植株叶表或根圈的生物膜形成/缠据时，所需基因表现及调控，将有助于应用Bacillus作为植物病害管理策略达到其最高效益。有关拮抗微生物B. subtilis 生物膜形成与其生物防治效力的相关性，Rudrappa等人研究发现受P.syringae感染的阿拉伯芥根部会分泌苹果酸（malic acid）诱引生物防治用根圈细菌B. subtilis FB17 缠据于根上，并形成厚实生物膜。其研究群团队亦证实B. subtilis缠据于阿拉伯芥根上形成生物膜，同时伴随产生脂胜肽抗菌物质surfactin，surfactin不仅为B. subtilis形成生物膜所需，其对P. syringae抑菌效力亦是保护植物免受感染，防治病害发生的关键因子。本研究室近期研究亦证实由中、南部地区所采集本土介质及根圈土壤分离拮抗性枯草杆菌可抑制柑桔溃疡病害发生，研究中特别针对枯草杆菌及溃疡病原于叶表形成生物膜能力与抑制病害相关性进行探讨，利用共轭焦雷射扫描显微镜配合绿荧光蛋白标定及吖啶橙（acridine orange）染色法观察，结果显示于接种溃疡病原前一天喷洒枯草杆菌群菌株TKS1-1及WG6-14可明显抑制溃疡病原于墨西哥莱姆叶表生物膜形成及缠据能力，另叶表多由枯草杆菌群菌株所缠据，且枯草杆菌的应用亦可明显降低单位叶表面积柑桔溃疡病斑数。此些结果显示，利用拮抗性枯草杆菌抑制溃疡病原于叶表形成生物膜能力，或许能降低柑桔溃疡病害的发生。
应用干扰细胞间讯息传递系统作为病害防治策略
细胞间讯息传递系统干扰作用的发现，始源于对微生物讯息分子及讯息传递系统机制的了解，自然界生物或微生物本身即存在多种酵素性及非酵素性干扰机制，随着对此机制的了解，亦有多种合成物质被研发出具相似功能，有关此主题的相关研究可参阅Kalia汇整之资料。干扰细胞间讯息传递系统策略包括：利用Bacillus的AHL-lactonase或Agrobacterium 和Ralstonia的AHLacylase，可分解讯息传递分子；利用triclosan抑制讯息分子生合成；以卤素化的furanones 或AHL 类似物抑制讯息接受或调控蛋白；另亦可应用trityl RWJ-49815或是salicylanilide closantel，干扰调控讯息系统的二元反应调控系统。其中不乏应用干扰细胞间讯息传递系统，调控依赖此系统的基因表现，进而成功影响细菌增殖、缠据作用、生物膜形成、侵入感染、致病性及代谢产物生合成等。其中由红藻Delisea pulchra所萃取的furanone 即被证实可抑制 E. coli XL1-Blue and JM109 生物膜的形成。另已知人工合成卤素化的furanone 可干扰P. aeruginosa LasI/LasR讯息传递系统，进而影响生物膜结构及抑制毒力因子表现。2001 年Dong等人证实将来自Bacillus菌属分解AHL 讯息分子的基因转殖入马铃薯，使其表现AHL-lactonase，则可使马铃薯对软腐病菌 Erwinia carotovora（syn. Pectobacterium carotovorum）的感染具有抗性，此为成功应用干扰细胞间讯息传递分子于植物病害防治的实例。另有研究证实添加Streptomyces讯息分子γ-butyrolactone（A-factor）至培养基中，可促进二次代谢抗生物质streptomycin 等的产生。
在脂肪酸类的讯息传递分子DSF 方面，Newman等人发现有多属细菌具有分解DSF 的能力，其中Pseudomonas spp. strain G 的分解能力主要由carAB 基因所调控，且自结球甘蓝上分离的B. cereus也具分解DSF的能力。CarAB为生成carbamoylphosphate的重要蛋白，主要调控嘧啶 （pyrimidine）及精胺酸（arginine）前驱物的生合成，此生合成基因删除时，突变株则呈现嘧啶与精胺酸营养缺失表现型。观察X. campestris于不同生长时序下DSF产生浓度发现， 当菌体在进入迟滞期（stationary phase）初期时，胞外累积的DSF数量达到最大值， 但随之即急速下降，依据此结果我们推测Xanthomonas菌属应有自体调控降解DSF机制，而此分解讯息传递分子DSF 机制或可作为研发由此属病原所导致病害的防治策略。
结论
生物膜形成为柑桔溃疡病菌维系其于叶表或寄主细胞内缠据存活及溃疡病征发展必需过程，藉由基因体序列比对分析、跳跃子突变菌株构筑，配合生物膜形成能力或致病性筛选及macroarray等分析，已鉴识出部分柑桔溃疡病原参与生物膜形成及溃疡病征表现的因子，包含类丝状血球凝集素、三仙胶、脂多糖等微生物附着及形成生物膜基质所需物质，另由鞭毛或非鞭毛驱动的泳动性亦参与此过程。而此病原亦可藉由第三型分泌系统送出致病有效蛋白或利用类plant natriuretic peptides改变寄主防御反应系统及影响植物生理生化功能，使之有利其侵入感染。部份参与生物膜形成过程及致病因子已被证实可由二元反应调控蛋白或rpf/DSF讯息传递系统调控，且其间的调控主要藉由细胞内二次讯息传递物质cyclic di-GMP 的转变及浓度调节。生物膜的形成及微生物讯息沟通系统在包括柑桔溃疡病原等多种微生物中已被证实在致病过程、共生作用等微生物交互作用中扮演极重要角色。因此可藉由化学药剂、生物制剂或酵素蛋白干扰或抑制讯息分子合成或调控功能及影响生物膜形成，而达病害防治效果。
