谢廷芳  陈俊宏  蔡志浓

“农业委员会”农业试验所

绪 言

果树产业在台湾农业生产中占有相当重要的地位，由2011年统计显示，各类果树栽培面积总计约19万公顷，总产量超过266万吨，产值约新台币791亿元。果树炭疽病是果树栽培收获后与储架期的重要病害之一，具有潜伏感染的特性，在果实收获后贮存、运输、贩卖时才会表现严重病征，造成重大损失，也是台湾许多果品外销的限制因子之一。虽然果树在小果期可利用套袋或选用化学药剂等方式防治，但炭疽病菌在果树开花期即可侵入感染，并潜伏于幼果表皮，此时期无法以套袋方式防治之，然而施用化学药剂常导致药害发生，且有病原菌易于产生抗药性、污染环境及对人体造成伤害之虞。因此，寻求更安全、对环境更友善的防治方法成为当前重要的课题。

为落实永续农业的目标，积极研发对环境及人体危险性较低的植物保护资材是重要选项，以减少化学药剂的施用，生产出无化学药剂残留，且对环境无害的安全农产品。目前研究显示利用植物成分以防治植物病害是较具安全性的途径之一，可利用植物先天固存的抑菌成分或后天经刺激产生的抗菌物质，以抵御植物病原菌的攻击。许多报告指出经提炼萃取后的植物精油，富含某些抑菌或抗菌物质，故本研究尝试筛选市面上常见且宣称具杀菌效果的植物精油，以六种常见果树炭疽病菌为对象，测试其抑菌的功效，并以香蕉果实测试其防治病害的效果，期能作为往后开发天然植物保护制剂的参考依据。

材料与方法

植物精油的搜集与母液的制备

由市面上购买常见的七种植物精油（振咏兴业有限公司），如肉桂、丁香、桉树、茴香、香茅、柠檬桉及百里香等精油，取各种植物精油原液与Tween 20（吐温20）以9﹕1的体积比例混合即成为母液，震荡均匀后置于褐色玻璃瓶中，于室温下储存备用。

病原菌接种源的制备

取农业试验所植物病理组真菌病害研究室保存的各种果树炭疽病菌菌株，如印度枣炭疽病菌、木瓜炭疽病菌、芒果炭疽病菌、文旦柚炭疽病菌、苹果炭疽病菌和香蕉炭疽病菌等，经两次单孢分离培养于马铃薯葡萄糖洋菜培养基试管斜面中，并置于24±2℃、每日12小时植物灯光照下培养约3星期。每一试管加入10毫升无菌水，经震荡后以两层纱布过滤，以血球计数器计算孢子浓度，并以无菌水调整孢子悬浮液浓度为每毫升约含10⁵个孢子。

植物精油对果树炭疽病菌孢子发芽的抑制效果

制备2%（w/v）水琼脂培养基平板，并加入葡萄糖溶液使其最终浓度达1%，于灭菌后倒平板前分别加入7种植物精油，并摇晃混合均匀，使其最终浓度分别为0、62.5、125、250、500、1000及2000μl/L。待水琼脂培养基冷却至室温后，取200μl的6种果树炭疽病菌孢子悬浮液分别加入含各种不同浓度精油的平板上，并以三角玻璃棒均匀涂抹，每处理每一精油浓度4重复。将各处理的培养皿以石腊膜密封后置于24±2℃定温箱中，16小时后取出观察计算孢子发芽率，发芽管长度超过孢子宽度始判定为发芽，每重复纪录100个孢子。每一处理不同浓度下的孢子发芽率数据再依网络版的ICEstimator Version 2.1（/index.htm）以非线性回归方法取得二元一次方程式y=a+bx+cx²，y为相对精油浓度下的孢子发芽率，x 为精油浓度，以算出孢子发芽的50%和99%抑制浓度。

植物精油对香蕉果实炭疽病的抑制效果

由市面上购得外表青黄、尚未完全成熟的成串香蕉果实，以70%酒精消毒过的干净剪刀剪下带有部分果柄、且表面无明显伤口或病斑的香蕉果实，分别浸泡入1000ml含500μl/L以Tween 20乳化的肉桂精油与丁香精油中，另以浸泡无菌水作为正对照组，完全未浸泡处理为负对照组，每一处理3重复，每一重复3根香蕉果实。室温下浸渍约10分钟后将果实捞起，于阴暗处风干约30分钟，再将各处理果实放置于干净的塑料盆中，以干净塑料袋套袋后静置于室温下。浸渍后当天起每天观察香蕉果实上病征发展，并记录每个果实上病斑占果实的面积百分率，本试验重复2次。

统计分析

各处理所得罹病面积率的差异显著性测验，系利用SAS 9.1统计分析软件（SAS Institute, Inc.2004）进行变方分析（analysis of variance, ANOVA)及最小显著差异性（least significant difference, LSD）测验。

结 果

植物精油对果树炭疽病菌孢子发芽的抑制效果以水琼脂培养基平板测试法检定各种植物精油对果树炭疽病菌孢子发芽的影响时发现，对于印度枣炭疽病孢子而言，不含精油时发芽率为98.25%，而500μl/L 的肉桂精油、丁香精油、柠檬桉精油、百里香精油及1000μl/L的香茅精油均可完全地抑制炭疽病菌孢子发芽；对于木瓜炭疽病孢子而言，不含精油时发芽率为98.85%，而500μl/L的肉桂精油、丁香精油、香茅精油、柠檬桉精油等及1000μl/L的百里香精油均完全地抑制孢子发芽；对香蕉炭疽病菌孢子而言，不含精油时发芽率为94.85%，而500μl/L的肉桂精油、百里香精油及1000μl/L的丁香精油、茴香精油、香茅精油均可完全抑制其孢子发芽；对芒果炭疽病菌孢子而言，不含精油时发芽率为98.05%，而500μl/L的肉桂精油、丁香油、柠檬桉精油及1000μl/L的香茅精油、百里香精油均可完全抑制其孢子发芽；对文旦柚炭疽病菌孢子而言，不含精油时发芽率为78.35%，而500μl/L的肉桂精油、丁香精油、香茅精油、柠檬桉精油及百里香精油均可完全抑制其孢子发芽；对苹果炭疽病菌孢子而言，不含精油时发芽率为97.25%，而同样地500μl/L的肉桂、丁香、香茅、百里香等精油及1000μl/L的柠檬桉精油均可完全抑制炭疽病菌孢子发芽。

以非线性回归方式求得7种植物精油对炭疽病菌孢子发芽的半数抑制浓度（IC₅₀），结果以肉桂精油的IC₅₀最低，亦即抑菌的效果最佳，IC₅₀均低于98.7μl/L，其中又以对木瓜炭疽病菌的抑菌能力最强，IC₅₀为39.1μl/L；而柠檬桉精油的抑菌能力次之，除对芒果与印度枣炭疽病菌的IC50 略高于丁香精油的IC₅₀外，对其他炭疽病菌的IC₅₀均低于丁香精油。在7种植物精油之中，对6种炭疽病菌的孢子发芽抑菌能力最差者为桉树精油，IC₅₀高于2100μl/L；而百里香精油对印度枣炭疽病菌的IC₅₀为100.6μl/L，仅次于肉桂油，显见炭疽病菌对精油的感受性亦有所不同。以IC₅₀的数据而言，7种精油对香蕉与木瓜炭疽病菌的抑菌能力由高而低依次为肉桂、柠檬桉、丁香、香茅、百里香、茴香及桉树精油，而对芒果、文旦柚及苹果的抑菌能力依次为肉桂、柠檬桉、丁香、百里香、香茅、茴香及桉树精油，而对印度枣炭疽病菌的抑菌能力则为肉桂、百里香、丁香、柠檬桉、香茅、茴香及桉树精油。肉桂精油对6种炭疽病菌的抑菌能力最强，而桉树精油的抑菌能力最差。反过来说，6种果树炭疽病菌对不同精油的感受性不一。例如，芒果、文旦柚及苹果炭疽病菌对香茅精油的感受性低于其它炭疽病菌，而香蕉炭疽病菌对茴香精油的感受性高于其它炭疽病菌。

另外，检视7种植物精油对炭疽病菌孢子发芽的99%抑制浓度（IC₉₉），其抑菌的趋势与IC₅₀的情形类似。以肉桂精油对6种炭疽病菌的抑菌能力而言，其IC₉₉ 低于156.3μl/L，其中对苹果炭疽病菌的IC₉₉ 为106.6μl/L 最低。

植物精油对香蕉果实炭疽病的抑制效果

以尚未完全成熟的香蕉果实浸渍于500μl/L的肉桂及丁香精油稀释液中，测试两种精油抑制香蕉炭疽病发生的效果。结果显示肉桂精油能有效降低香蕉果实上炭疽病的罹病斑面积率，与不处理或以水处理的对照组呈现显著性（P＜0.05）差异，而丁香精油则于处理后隔天即有促进香蕉产生炭疽病斑的现象，至第6天已严重发病，并较对照组的香蕉展现严重的炭疽病病征。一般而言，以500μl/L肉桂精油稀释液浸渍处理效果最佳，具有明显抑制香蕉炭疽病的效果。而对照组不论浸泡无菌水与否，在第3天皆可观察到出现明显病斑，至第6天则病斑增多且趋严重。

讨 论

果树炭疽病是影响台湾水果橱架寿命的限制因子之一，而目前水果外销产业日渐蓬勃，更需要积极开发病害防治技术。农民防治果树炭疽病的主要方法为果实套袋与化学药剂防治，但许多果树在开花期及幼果期不适合套袋，参考植物保护手册选用推荐的化学药剂时，又常产生药剂种类繁多，使农民面临选择上的困扰，某些药剂更面临病原菌产生抗药性或防治效果不佳的问题而需重新筛选。为实现农业永续与农产品安全的目标，积极寻找对自然环境友好及人体健康低危险性的天然资材，进一步研制植物保护制剂，以减少或取代化学药剂的施用，生产无化学药剂残留的安全农产品，成为当前重要的课题之一。植物抑菌成分分为五大类：萜类与精油、酚类与多酚、生物碱、多胜肽及混合物（粗萃物），其中植物精油富含某些杀菌或抑菌成分的物质，具有一定的抑菌与防病能力。本研究测试7种植物精油对6种常见果树炭疽病菌孢子发芽的抑制效果。结果7种精油中以肉桂、丁香及柠檬桉三种精油的抑菌能力最佳，IC₅₀分别小于98.7、155.7及190.5μl/L。而就炭疽病菌对精油的敏感性而言，各炭疽病菌对同一种精油的反应不一，如芒果、文旦及苹果炭疽病菌对香茅精油的感受性低于其它炭疽病菌，而香蕉炭疽病菌对茴香精油的感受性高于其它炭疽病菌。蔡氏等（2006）测试杀菌剂对三种果树炭疽病菌的抑制效果，发现菌株问对杀菌剂的反应不一，表明菌株抗药性是主因。而本研究中除香蕉炭疽病菌为C. musae 外，其它果树炭疽病菌均为C. gloeosporioides，但不同来源的C. gloeosporioides 对精油的感受性不一，其原因是否为菌株已有寄主分化性或其它原因，则尚待进一步研究。另外，以肉桂精油、丁香精油500μl/L稀释液处理香蕉果实后，发现肉桂油具有降低香蕉炭疽病发生的效果，而丁香精油则促进病害，推测丁香精油促进病征表现之因，可能与精油造成香蕉果皮表面灼伤而利于病势进展有关。

大多数研究植物精油对植物病原真菌抑菌能力的报告都以测定菌丝生长与孢子发芽的抑制作用为主。在抑制菌丝生长方面，如Ranasinghe氏等指出肉桂及丁香油在0.03 - 0.11%（v⁄v）下可抑制Fusarium proliferatum、Lasiodiplodia theobromae 和Colletotrichum musae 等引起香蕉冠腐及炭疽病的病原菌菌丝生长：百里香精油在0.06%下可让C.loeosporioides 和Rhizopus stolonifer 二者的菌丝停止生长，而0.05%的香茅精油和0.4%的肉桂精油对香蕉炭疽病菌C. musae 和木瓜炭疽病菌C.gloeosporioides 具有杀菌效果。植物精油包括Lippia sidoides、丁香罗勒、马鞭草柠檬桉和香茅在1000μl/L下可完全抑制炭疽病菌菌丝生长，而柑桔油在150mg/L 可完全抑制芒果炭疽病菌菌丝生长。亦有一些报告利用精油的挥发性物质来达到抑菌的功效，如百里香精油在76μl/L下的挥发气体可完全抑制炭疽病菌Colletotrichum acutatum 的菌丝生长，同样的效果下，肉桂与丁香精油的使用浓度需为107μl/L，而百里香与肉桂精油在浓度分别为107和153μl/L时具有杀菌效果。亚香茅、罗勒、柠檬桉和白豆蔻等精油在0.03-0.66%（v/v）下对L. theobromae, F. proliferatum和C. musae 具静菌作用，而在0.05-0.66%（v/v）下有杀菌效果。

在抑制孢子发芽方面，50mg/L的芥子精油抑制70.8%炭疽病菌孢子发芽，而罗勒精油则抑制64.7%孢子发芽。Midhila 和Janardhana测试7种植物精油抑制咖哩树炭疽病菌孢子发芽与发芽管长度，发现不同精油的抑菌浓度不一，柑桔油在1360mg/L时达最大抑制量，其次为1720mg/L的香茅油和2260mg/L的薄荷精油。而Souza Júnior氏等以1000μl/L的精油包括Lippia sidoides, 丁香罗勒、马鞭草柠檬桉、香茅和番石榴等具有完全抑制C. gloeosporioides 孢子发芽的效果。肉桂与丁香精油对黑胡椒炭疽病菌孢子发芽的半致死浓度小于650mg/L。Rozwalka等指出精油对炭疽病菌孢子的杀菌作用主要是使细胞解体或退化而导致孢子无法发芽。

据许多文献报导，在果树开花结果期时，炭疽病菌可能就已经侵入而潜伏，在以香蕉果实为对象的防治试验中，直接从市面上购买尚未成熟、外表青黄但没有明显伤口或炭疽病斑的香蕉果实，由于推测购买的香蕉果实在尚未采收前就极有可能被炭疽病菌侵入潜伏，因此本试验中不再接种炭疽病菌，直接将香蕉浸泡于筛选出的肉桂及丁香精油的500μl/L水溶液中10分钟，取出后观察发病情形。结果香蕉在处理丁香精油后隔天即产生疑似炭疽病病斑，至第6天发病情形较对照组严重，而罹病组织经分离后，确定该病斑皆为炭疽病菌所致。而处理肉桂精油的香蕉果实至第6天，除果实外表转黄成熟外，病斑数目与病斑面积的进展均十分缓慢，显示在浸泡肉桂精油后，炭疽病菌在果实上的进展与危害受到限制而达到防治效果；而处理丁香精油则可能造成香蕉果实受伤，反而使炭疽病发病更加严重。

纯粹利用植物精油防治果树炭疽病的报告不多，如黄色百香果浸于 120mg/L香茅油溶液中2分钟可防治由C. gloeosporioides 引起的炭疽病，木瓜果实浸于0.12%（w/w）百里香精油和0.1%（w/w）墨西哥莱姆精油溶液中可预防炭疽病危害达50%，而250μl/L芥子精油和罗勒精油分别降低芒果果实炭疽病达79.9%和66.7%。多数报告利用精油处理果实时都辅以佐剂配方或配合其它措施，以加强精油的防病效力，如木瓜浸于分别含0.1%百里香或0.5%墨西哥莱姆精油的牧豆树胶乳剂中，可完全防治炭疽病的发生；以10%阿拉伯胶混合0.4% 肉桂油作为生物农药可防治香蕉和木瓜果实炭疽病；另外以150MPa高静水压配合750mg/L植物精油（柑桔与香茅）可作为木瓜果实炭疽病的防治方法。然而，使用精油防治果实炭疽病常会造成药害的发生，Yulia氏等测试多种植物精油发现高浓度下可抑制炭疽病菌的生长，但会造成辣椒切离叶产生药害的情形，如由丁香芽和叶片萃取的精油造成中度毒害，而由肉桂树皮和叶片萃取的精油则产生严重毒害。百香果果实浸泡于120mg/L香茅油中造成33.3 %果实的果皮发生褐变，250mg/L时引起76.6%果实褐变，而500mg/L时则发生100%褐变，严重影响外观与质量，且高浓度精油处理之下使果皮褐变而罹病化，导致罹病指数偏高。

综合本研究结果发现，肉桂精油在500μl/L时具有防治香蕉果实炭疽病发生的功效，试验期间亦无发生药害的现象，显示具有发展为天然植物保护制剂的潜力。日后可进一步进行大范围的温室试验或更大量的果实试验，以检验肉桂精油可否应用于天然植物保护制剂的研发与制作，甚至普遍应用于实际田间栽培管理，或是果实采收后储存或运输时施行的浸药措施。